RealPAGE®彩色PAGE凝膠快速制備試劑盒（一步法）
RealPAGE® One-Step Colour PAGE
Gel Fast Preparation Kit
|
貨 號
|
名 稱
|
可制膠數(shù)量
|
|
RTD6134-Y
|
制備6%PAGE膠，黃色上層膠
|
125塊 0.75 mm膠
＞90塊1.0 mm膠
＞60塊1.5 mm膠
|
|
RTD6134-G
|
制備7.5%PAGE膠，綠色上層膠
|
|
RTD6134-B
|
制備10%PAGE膠，藍色上層膠
|
|
RTD6134-R
|
制備12.5%PAGE膠，紅色上層膠
|
|
RTD6134-V
|
制備15%PAGE膠，紫色上層膠
|
● 貨品內(nèi)容：
|
組份
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
1
|
上層膠溶液（2×）
|
80 ml
|
|
2
|
上層膠緩沖液（2×）
|
80 ml
|
|
3
|
下層膠溶液（2×）
|
250 ml
|
|
4
|
下層膠緩沖液（2×）
|
250 ml
|
|
5
|
改良型促凝劑
|
10 ml
|
|
6
|
刻度配膠杯
|
6個
|
|
7
|
說明書
|
一份
|
● 運輸、貯存及效期：
本產(chǎn)品常溫運輸；4-8℃貯存，其中配制后的改良型促凝劑貯存于-20℃；有效期一年。
● 產(chǎn)品特點：
快速制備凝膠：無需液封等待下層膠凝固，即可直接灌注上層膠，制膠更省時；
彩色上層膠：可制備五種顏色的上層膠，為點樣和區(qū)分不同凝膠提供便利；
避免異味：無需使用 TEMED，環(huán)境安全友好；
凝膠高穩(wěn)定性：中性pH凝膠,有效提高凝膠穩(wěn)定性,密封條件下，凝膠可以四度貯存6個月。
兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可用于非變性電泳（Native-PAGE）。
● 產(chǎn)品簡介：
該產(chǎn)品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理，采用上層膠和下層膠的預(yù)混配方，只需加入改良型促凝劑即可凝膠，灌入下層膠后，無需等待凝膠，直接灌入上層膠即可，簡便快捷可在15分鐘內(nèi)配制得到高質(zhì)量的聚丙烯酰胺凝膠，可用于變性和非變性蛋白凝膠電泳，適用于Tris-甘氨酸電泳體系（Laemmli體系）。五種上層膠顏色設(shè)計，點樣孔清晰易辨，方便點樣，可以配制6%（黃色上層膠）、7.5%（綠色上層膠）、10%（藍色上層膠）、12.5%（紅色上層膠）和15%（紫色上層膠）的分離膠濃度，可以滿足絕大多數(shù)蛋白電泳需求。
本產(chǎn)品配套提供改良型促凝劑 ，其具有更好的穩(wěn)定性和催化效能，配膠過程中無需額外添加TEMED。為方便操作，已開蓋使用中的改良型促凝劑，可置于 4℃保存至少三個月。
本試劑盒大約可以配制60-125塊常規(guī)大?。?×10 cm）的PAGE凝膠，具體數(shù)量根據(jù)凝膠厚度決定：0.75 mm厚度凝膠可以配制125塊膠，1.0 mm厚度凝膠可以配制至少90塊膠，1.5 mm厚度凝膠可以配制至少60塊膠。
● 使用說明：
一. 制膠前的準備：
1.1 即用型改良型促凝劑配制：
試劑盒提供的改良型促凝劑為干粉，第一次使用前加入10 ml超純水，徹底溶解后使用。配制好的即用型改良型促凝劑置于4℃?zhèn)溆茫L期不用建議-20℃貯存。
1.2
推薦操作：
實驗前半小時，取出試劑盒所有組份，常溫靜置半小時使溶液恢復(fù)到常溫后輕柔混勻后使用，可以有效降低制膠時產(chǎn)生氣泡的可能性。
二. 凝膠配制(以一塊0.75/1.0/1.5 mm厚度的8×10cm膠為例)：
2.1取等體積彩色上層膠緩沖液和上層膠溶液，各0.5/0.75/1.0 ml，混勻；
注：由于染料的特殊理化性質(zhì)，彩色上層膠緩沖液使用前請搖勻。
2.2取等體積下層膠緩沖液和下層膠溶液，各2.0/2.5/4.0 ml，混勻；
2.3
向步驟2.1的上層膠混合溶液中加入10/15/20
μl改良型促凝劑，輕輕混勻。
注：加入改良型促凝劑后，需輕柔混勻，防止過多氧氣混入膠溶液，抑制凝膠聚合和導(dǎo)致凝膠內(nèi)可能產(chǎn)生氣泡。
2.4
向步驟2.2的下層膠混合溶液中加入40/50/80
μl改良型促凝劑，輕輕混勻；將溶液注入制膠玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之間的距離為約1.5
cm或距離梳齒下沿距離為約0.5
cm即可；
注：此溶液為過量，請勿全部注入，可留少許于制膠杯中，便于判斷凝膠狀態(tài)；加入改良型促凝劑后，需輕柔混勻，防止過多氧氣混入膠溶液，抑制凝膠聚合和導(dǎo)致凝膠內(nèi)可能產(chǎn)生氣泡。
2.5 無需等待下層膠凝固，迅速將步驟2.3的上層膠混合溶液左右平移緩慢輕柔注入制膠玻璃板中，插入梳齒。
注：加入下層膠混合液后，請在1-2分鐘內(nèi)灌注上層膠混合溶液，加入時一定要輕緩，避免將上層膠溶液沖入下層膠；凝固后上下層膠分界線平整度略弱于使用封閉方法配制的凝膠，但對后續(xù)電泳沒有影響。
2.6 待膠凝固后拔去梳齒，用注射器或槍頭吸取電泳緩沖液將加樣孔沖洗干凈，即可進行常規(guī)電泳操作。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。
溫度與凝膠時間參考表
|
環(huán)境溫度
|
18℃
|
25℃
|
37℃
|
|
凝固時間
|
~20 min
|
~15 min
|
~10 min
|
附：凝膠配方表
|
表一 彩色上層膠配方
|
表二 下層膠配方
|
|
膠厚度
|
彩色上層膠緩沖液
|
上層膠溶液
|
促凝劑
|
膠厚度
|
下層膠緩沖液
|
下層膠溶液
|
促凝劑
|
|
0.75 mm
|
0.5 ml
|
0.5 ml
|
10 μl
|
0.75 mm
|
2.0 ml
|
2.0 ml
|
40 μl
|
|
1.0 mm
|
0.75 ml
|
0.75 ml
|
15 μl
|
1.0 mm
|
2.5 ml
|
2.5 ml
|
50 μl
|
|
1.5 mm
|
1.0 ml
|
1.0 ml
|
20 μl
|
1.5 mm
|
4.0 ml
|
4.0 ml
|
80 μl
|
三. 電泳：
3.1 變性電泳：
|
電泳緩沖液
|
5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液
|
|
上樣緩沖液
|
5×蛋白上樣緩沖液（變性，還原）
|
|
電泳條件
|
恒壓 200 V 40-55 min
|
3.2 非變性電泳：
|
電泳緩沖液
|
5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液
|
|
上樣緩沖液
|
5×蛋白上樣緩沖液（非變性，非還原）
|
|
電泳條件
|
恒壓150 V 50-65 min
|
非變性電泳必看：該凝膠體系pH大約8左右，適用于等電點pI小于8的蛋白電泳分離，pI越遠離8，帶的負電荷越多，分離就更容易；等電點接近8或者高于8的蛋白不適合用該系統(tǒng)進行非變性電泳。
四. 凝膠染色或轉(zhuǎn)膜：
4.1 凝膠染色可以選擇FastBlue蛋白快速染色液(貨號：RTD6202)， 可以在30分鐘內(nèi)完成染色和脫色，也可以選擇常規(guī)法考馬斯亮藍蛋白染色液（貨號：RTD6203）。
4.2 轉(zhuǎn)膜緩沖液可以使用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)膜。濕轉(zhuǎn)法可以使用經(jīng)典Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：TB1040）或者使用10×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液（貨號：RT5020）。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜可以使用5×RealBlot快速半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：RT5030）。
五. 凝膠濃度選擇參考：
|
目的蛋白分子量
|
下層膠濃度
|
壓縮前沿
|
|
10 kD以下
|
15%
|
~6 kD
|
|
10-45 kD
|
12.5%
|
~10 kD
|
|
45-100 kD
|
10%
|
~15 kD
|
|
100-180 kD
|
10%/7.5%
|
~15 kD/~25 kD
|
|
180-250 kD
|
7.5%
|
~25 kD
|
|
250 kD以上
|
6%
|
~60 kD
|
|
上圖為 Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)中，蛋白分子量標準 (10-180
kDa，含有 10 條蛋白條帶 ) 在不同濃度的 SDS-PAGE凝膠中的分離示意圖。因溫度、pH 值等因素不同，實際分離情況會略有出入，本圖僅供參考。
|