Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠快速制備及電泳試劑盒（含預(yù)染Marker）
Ver.750270-2.0
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貨號(hào)
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名稱(chēng)
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規(guī)格
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RTD6121
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Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠快速制備及電泳試劑盒（含預(yù)染Marker）
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10次
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● 產(chǎn)品組成：
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序號(hào)
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組分貨號(hào)
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名稱(chēng)
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規(guī)格
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貯存
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1
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RTD6121-01
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2×PAA濃縮膠聚合溶液
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15 ml
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4℃
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2
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RTD6121-02
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2×PAA分離膠聚合溶液
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30
ml
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4℃
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3
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RTD6121-03
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2×凝膠緩沖液
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40
ml
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4℃
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4
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RTD6148
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雙色預(yù)染超低分子量蛋白質(zhì)Marker
(1.5-42 kD)
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10次
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-20℃
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5
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TP080-01
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2×Tricine多肽上樣緩沖液（變性，還原,含溴酚藍(lán)）
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1
ml
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-20℃
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6
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AP020P
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10%
APS（干粉）
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5 ml
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RT，配制后-20℃
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7
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光保存
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8
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CB010P
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10×Tris-Tricine-SDS緩沖液(變性電泳,粉末型)
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500
ml
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RT，配制后4℃
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9
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RTD6202-02
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FastBlue蛋白染色液
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500
ml
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RT
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
該產(chǎn)品含有多肽電泳全套試劑，可以用來(lái)檢測(cè)1-20
kD的多肽大小。本試劑盒可配制至少10塊常規(guī)大?。?×10cm）,厚度1 mm的PAGE膠。該產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：
1. 分辨率高：凝膠緩沖液獨(dú)特配方，可以有效分離1-5 kD多肽；
2. 使用方便：制膠無(wú)需計(jì)算所需溶液量；無(wú)需制備三層凝膠（濃縮膠，夾層膠，分離膠）；
3. 配套 Tris-Tricine-SDS緩沖液，無(wú)需區(qū)分陽(yáng)極緩沖液和陰極緩沖液;
4. 試劑盒配套有預(yù)染蛋白Marker，方便檢測(cè)多肽大??；
5. 試劑盒配套有快速蛋白染色液，最快可以在30分鐘內(nèi)完成染色過(guò)程，有效避免小肽從凝膠中游離。
● 貯存、運(yùn)輸及效期：
按照標(biāo)簽溫度貯存；濕冰運(yùn)輸；有效期一年。
● 使用說(shuō)明：
一. 制膠：
10%APS溶液配制：
10% APS為固體粉末，使用前加入5 ml雙蒸水溶解即配制成10% APS溶液，將溶液分裝后置于-20℃保存，通常一年內(nèi)有效。該溶液在4℃條件下可以穩(wěn)定保存兩周。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時(shí)間延長(zhǎng)，應(yīng)考慮更換使用-20℃保存的10% APS溶液。
1.1 配制分離膠:
1.1.1按照表一將不同體積的成分加入到小燒杯中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。
表1 （一塊厚度1 mm 8×10cm凝膠膠用量）*
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分離膠
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濃縮膠
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18％T5C
/5 ml
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4％T
2.6C/1.5 ml
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2×凝膠緩沖液
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2.5 ml
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0.75 ml
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2×PAA濃縮膠聚合溶液
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/
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0.75 ml
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2×PAA分離膠聚合溶液
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2.5 ml
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/
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10%APS
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~50 μl
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~15 μl
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TEMED
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~5 μl
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~1.5 μl
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注： * 如非必須，不要使用厚度1.5 mm的凝膠，盡量使用厚度1 mm的凝膠，這樣會(huì)減少電泳后染色和脫色的時(shí)間。
1.1.2 在玻璃板中迅速灌入適量分離膠溶液，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長(zhǎng)0.5
cm即可。注：此溶液為過(guò)量，請(qǐng)勿全部注入。
1.1.3
然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無(wú)水乙醇層，使凝膠表面保持平整。
1.1.4 靜置10-30分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。分離膠在25℃條件下，約20分鐘可以聚合。
1.2 配制濃縮膠:
去除覆蓋在分離膠上的乙醇層，用濾紙將殘留的乙醇吸去。
1.2.1 按照表一將不同成分加入到小燒杯中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。
1.2.2 將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
1.2.3 靜置30-50分鐘待凝膠聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。濃縮膠在25℃條件下，約40分鐘可以聚合。
二. 電泳：
2.1 變性電泳緩沖液和樣品配制：
2.1.1 10×Tris-Tricine-
SDS緩沖液配制：
將10×Tris-Tricine-SDS緩沖液（10×TTS）粉末（Cat：CB010P）置于一干凈的燒杯中，加入500 ml超純水，徹底攪拌混勻，不要調(diào)節(jié)pH，即配成500 ml 10×緩沖液。超純水稀釋10倍配成1×Tris-Tricine-SDS緩沖液。
2.1.2 變性樣品處理：
待上樣的檢測(cè)樣品與2×Tricine上樣緩沖液（變性，還原，含溴酚藍(lán)）[Cat No：TP080]等體積混合，95℃處理5分鐘后上樣。蛋白Marker一般已經(jīng)含有上樣緩沖液，根據(jù)說(shuō)明書(shū)上樣（預(yù)染Marker不能加熱處理，非預(yù)染Marker上樣前一般要95℃處理5分鐘）。試劑盒配套的預(yù)染Marker（Cat：RTD6148）不要加熱處理，溶化混勻后直接上樣，1 mm厚度10齒梳子建議上樣3-5 μl。
2.2 電泳：
將電泳槽的內(nèi)槽加滿(mǎn)電泳緩沖液，輕柔拔出梳子，用1 ml移液器將梳孔吹洗干凈，將Marker或蛋白樣品加入點(diǎn)樣孔，穩(wěn)壓電泳（表2），至溴酚藍(lán)指示前沿至分離膠下沿位置時(shí)即可停止電泳。整個(gè)電泳過(guò)程大約需要2.5-3個(gè)小時(shí)。
表2 多肽電泳條件（單板電泳）
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電壓
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電流變化
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電泳時(shí)間
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濃縮膠
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恒壓80 V
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起始電流：30-35 mA
終止電流：25-30 mA
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~20
min
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注：等待樣品指示前沿到達(dá)分離膠上沿時(shí)，調(diào)高電壓
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分離膠
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恒壓120 V
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起始電流：40-45 mA
終止電流：15-20 mA
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~200
min
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注：恒壓條件下，電流不可調(diào)節(jié)，電流是逐漸降低的，觀(guān)察記錄電流數(shù)值。
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三. 染色：
3.1將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中,用適量蒸餾水漂洗，去除膠表面的SDS，殘余SDS會(huì)導(dǎo)致染色液出現(xiàn)沉淀。
3.2 棄蒸餾水，加入適量染色液（以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適)，搖床上常溫?fù)u動(dòng)，根據(jù)下表確定染色時(shí)間。
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待檢測(cè)蛋白量
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染色時(shí)間
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＞1 μg
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~5分鐘
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100 ng-1
μg
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~10分鐘
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10 ng-100
ng
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~60分鐘
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3. 3 搖床上搖動(dòng)至所有條帶清晰可見(jiàn)。
3. 4 蒸餾水搖動(dòng)漂洗脫色1-2次，每次5-10分鐘，至凝膠背景干凈。
3. 5 收集用過(guò)的染色液，可以重復(fù)使用2-3次。
凝膠也可以使用常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液和脫色液進(jìn)行染色和觀(guān)察。需要注意的是，常規(guī)染色和脫色方法需要較長(zhǎng)時(shí)間，小肽由于長(zhǎng)度較短，和凝膠結(jié)合不緊密，長(zhǎng)時(shí)間在溶液中浸泡容易從凝膠中脫離。FastBlue蛋白染色液除具有染色快，無(wú)毒，靈敏性高等特點(diǎn)外，還能對(duì)小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。
四. 轉(zhuǎn)膜：
多肽轉(zhuǎn)膜選擇孔徑0.22
μm PVDF膜（用前用甲醇處理潤(rùn)濕）或0.22 μm NC膜。
4.1 半干轉(zhuǎn)：
使用伯樂(lè)Trans-Blot Turbo半干轉(zhuǎn)機(jī)器請(qǐng)選擇配套的5×RealBlot快速半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：RT5030）。轉(zhuǎn)膜推薦條件：一板小型凝膠（8×10
cm）恒流，1.3 A，7-10 min。
4.2 濕轉(zhuǎn)：
濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20%
Methanol,pH~8.3），可以選擇10×Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（濕轉(zhuǎn)，溶液型）（貨號(hào)：TB1040）。轉(zhuǎn)膜條件：恒流200
mA 40-60 min。
五. 實(shí)驗(yàn)示例：
多肽電泳配套試劑