植物過氧化氫酶CAT檢測試劑盒（鉬酸銨微板法）
Plant
Catalase Assay Kit（Ammonium molybdate，Spectrometer Method） Ver.751173-1.0
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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CT1060M
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植物過氧化氫酶檢測試劑盒（鉬酸銨微板法）
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100次
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● 產(chǎn)品組成：
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組分貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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CT1060M-01
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提取液
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100 ml
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4℃
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CT1060M-02
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檢測緩沖液
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30 ml
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4℃
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CT1060M-03
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顯色底物（粉末型）
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30 ml
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4℃，避光
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CT1060M-04
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過氧化氫（約1 M）
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1 ml
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4℃，避光
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說明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡介：
植物過氧化氫酶檢測試劑盒 (Plant Catalase Assay Kit)是一種簡單易行的通過顯色反應(yīng)來檢測植物體內(nèi)過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性的試劑盒。測定原理簡述如下：樣品中的過氧化氫酶（CAT）在過氧化氫相對比較充足的情況下，可以催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧氣（酶促反應(yīng)），反應(yīng)式為：2H2O2→2H2O+O2；酶促反應(yīng)后殘余的過氧化氫與鉬酸銨產(chǎn)生具有吸收波長為405 nm的黃色產(chǎn)物（顯色反應(yīng)），平行對照反應(yīng)中含有已知濃度的初始過氧化氫濃度，通過計算對照反應(yīng)與樣本反應(yīng)A405讀數(shù)的差值，確定酶促反應(yīng)中有多少過氧化氫被CAT催化分解，根據(jù)計算公式計算出樣品中CAT活性。
本試劑盒的CAT活性測定特點(diǎn)是從紫外波長（240 nm）轉(zhuǎn)換到可見波長（405 nm）檢測，無需使用紫外比色皿或UV微孔板。同時也避免了使用UV測定法中蛋白質(zhì)在A240吸收對測定結(jié)果的嚴(yán)重干擾。
本試劑盒用于檢測植物樣品中的過氧化氫酶的活性，不推薦用于動物以及體液樣品CAT活性的檢測。
使用酶標(biāo)儀檢測，以每次提取使用1 ml提取液，測試體系每次0.3 ml計算，該試劑盒可以進(jìn)行約100次檢測。
● 貯存、運(yùn)輸及效期：
4℃貯存；常溫運(yùn)輸；有效期6個月。
● 自備材料：
植物材料；研缽；石英砂；聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）；1 ml石英比色皿（光程1 cm）（校正過氧化氫濃度用）；酶標(biāo)儀（檢測波長405 nm）；低溫臺式離心機(jī)；可調(diào)式移液器；冰；蒸餾水。
● 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，設(shè)定波長到405 nm。
2. 取出試劑盒組份，常溫放置30分鐘，平衡溫度至常溫。
3. 提前打開制冰機(jī)。
● 操作步驟：
一．試劑盒的準(zhǔn)備工作：
1.1 測定過氧化氫溶液精確濃度：
本試劑盒提供的過氧化氫濃度約為1 M。由于過氧化氫不是很穩(wěn)定，使用前需自行測定過氧化氫的實(shí)際濃度。方法如下：首先把濃度約為1 M的過氧化氫用蒸餾水稀釋100倍，使過氧化氫的濃度約為10 mM。隨后用如下方法之一測定A240：
1.1.1普通紫外分光光度計法：
使用紫外分光光度計，使用1 ml石英比色皿（光程1 cm），用蒸餾水作為對照，測定A240。
注：用比色皿檢測的過氧化氫濃度最接近實(shí)際濃度。
1.1.2 96孔紫外酶標(biāo)儀法(必須能檢測240 nm波長)：
根據(jù)96孔板的參數(shù)確定光程，一般200微升樣品的光程為0.552 cm (樣品體積除以96孔單孔孔內(nèi)橫截面面積)。一般建議使用專用的96孔紫外檢測板(如96孔UV板)，如果沒有紫外檢測板，也可使用一般的96孔板，但由于不是紫外檢測專用板，會有非常高的紫外吸收信號，所以需要設(shè)置含等量蒸餾水的孔作為空白對照(一般200 μl水在該類96孔板的A240在3.8左右)，計算時須減去該空白對照。在使用非紫外檢測專用板的情況下，由于96孔酶標(biāo)儀在240 nm的檢測上限有限，建議將過氧化氫稀釋至約10 mM左右后再進(jìn)行濃度測定。
注意：以上所有方法都需要設(shè)置等量蒸餾水作為空白對照，并在計算時減去該空白對照。
1.1.3 過氧化氫精準(zhǔn)濃度計算：
計算公式： c=A/(ε× b)。其中： c為樣品濃度(單位為mol/L或M)； A為吸光值； ε為波長依賴的摩爾消光系數(shù)(單位為L× mol-1× cm-1或M-1×
cm-1)，過氧化氫的摩爾消光系數(shù)為43.6 M-1cm-1； b=光程(單位為cm)。過氧化氫濃度(M)=A240/(43.6×
b)；即：過氧化氫濃度(mM)=22.94× A240/b。
示例1-微孔板測定濃度：
將本試劑盒提供的約為1 M的過氧化氫用蒸餾水稀釋100倍后，用96孔酶標(biāo)儀，使用普通96孔板進(jìn)行檢測，每孔200微升，每組3個平行。蒸餾水對照組的平均A240為3.750，過氧化氫樣品組的平均A240為3.974，差值為0.224， 200微升樣品的光程為0.552 cm，代入公式，過氧化氫濃度(mM)=22.94× 0.224/0.552=9.31 mM，則實(shí)際本試劑盒提供的過氧化氫濃度為0.931 M。
示例2-石英比色皿測定濃度：
取蒸餾水1980 μl，加入本試劑盒提供的約為1 M的過氧化氫20 μl（稀釋100倍）混勻，取1ml混合液加入到1 ml 石英比色皿中（光程1 cm），用1 ml蒸餾水作為對照，用紫外分光光度計測定混合液的A240=0.435，代入公式，過氧化氫濃度(mM)=22.94×0.435/1=9.98 mM，則實(shí)際本試劑盒提供的過氧化氫濃度為0.998 M。
1.2 配制20 μmol/ml（20 mM）過氧化氫溶液：
根據(jù)測定得到的實(shí)際過氧化氫濃度用檢測緩沖液配制成20 μmol/ml（20 mM）過氧化氫溶液，該溶液建議使用棕色管配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃避光可以貯存3天。
注：進(jìn)行一次樣品測定，可以配制1 ml 20 mM過氧化氫溶液。
1.3 配制顯色底物：
顯色底物提供的是粉末包裝，取一瓶粉末裝顯色底物，加入30 ml蒸餾水，徹底混勻至粉末完全溶解；顯色底物溶液配制后4℃避光貯存。
二．樣本處理：
1.1 取新鮮植物組織，按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（ml）為~1：10的比例進(jìn)行冰浴勻漿，制成10%勻漿液，如0.1 g 組織，加入1 ml提取液，進(jìn)行冰浴勻漿；
注：水分充足的樣品可以制成5%勻漿液（0.5 g：10 ml）；對于纖維含量多的植物如水稻葉片，可加入適量石英砂（試劑盒不提供，自備）輔助研磨，提高研磨效率；對于多糖多酚含量高的植物，可以在提取液中加入1% PVPP（試劑盒不提供，自備），能有效去除多糖多酚對活性測定的干擾。
1.2 12000 rpm，4℃離心10 min，取上清，即為含有CAT的樣本，置冰上待測。
注：提取的樣本如需貯存，4℃貯存3天；建議按需分裝后-80℃貯存，兩周內(nèi)使用，盡量避免反復(fù)凍融；不建議-20℃貯存。
三． 樣品測定：
3.1 表一 樣品測定流程表（0.3 ml測定體系）：
在1.5
ml離心管中配制如下反應(yīng)：
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反應(yīng)1
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反應(yīng)2
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反應(yīng)3
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反應(yīng)4
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空白管
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標(biāo)準(zhǔn)管
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樣本對照管
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樣本測定管
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酶促反應(yīng)
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20 mM 過氧化氫溶液
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0 μl
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90 μl
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0 μl
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90 μl
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檢測緩沖液
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120 μl
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30 μl
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120-x μl
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30-x μl
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樣本體積
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0 μl
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0 μl
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x μl
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x μl
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25℃反應(yīng)10 min （加入樣本后立即準(zhǔn)確計時）
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注1：原理-樣品中的CAT分解過氧化氫底物，反應(yīng)4中會有氣泡產(chǎn)生，氣泡越多說明樣本中CAT活性越強(qiáng)；
注2：不同植物材料，CAT活性差異很大，10%勻漿液x經(jīng)驗(yàn)值一般為3-10；
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顯色反應(yīng)
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立即向酶促反應(yīng)中加入180 μl顯色底物；
25℃孵育10 min后讀數(shù)A405；
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注1：原理-樣品中過氧化氫與顯色底物反應(yīng)；
注3：顯色示例
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3.2 酶促反應(yīng)：
參考表一，在1.5 ml離心管中，加入溶液，用移液器迅速混勻；25℃ 精確計時反應(yīng)10分鐘。
3.3顯色反應(yīng)：
立即向酶促反應(yīng)管中加入180 μl顯色底物，混勻。
3.4 讀數(shù)：
取200
μl溶液加到微孔板中，25℃孵育10分鐘后測定樣品A405。
四. 活性計算：
4.1 按照分解過氧化氫微摩爾數(shù)計算：
單位定義：在25℃ pH7.0的條件下，在1分鐘內(nèi)可以催化分解1微摩爾過氧化氫為1個酶活力單位（U/ml）。
計算公式：CAT活性（U/ml）=
注解：
△標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白；△測定=A測定-A對照；△A=△標(biāo)準(zhǔn)-△測定
T（min）：10，CAT酶促反應(yīng)的實(shí)際時間為10 min
過氧化氫濃度（μmol/ml）：20，酶促反應(yīng)中使用的過氧化氫濃度為20 mM（μmol/ml）
V標(biāo)準(zhǔn)（ml）：0.09，酶促反應(yīng)中加入過氧化氫體積數(shù)為90 μl
顯色反應(yīng)總體積（ml）：0.3，顯色反應(yīng)總體積為0.3 ml
V樣（ml）：酶促反應(yīng)中加入的樣本體積x μl，轉(zhuǎn)換為ml數(shù)
D= 樣本稀釋倍數(shù)，未稀釋為1
1.5：300 μl反應(yīng)體系中取200 μl讀數(shù)
計算示例-綠蘿CAT活性測定-按照分解過氧化氫微摩爾數(shù)計算：
取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，按照測定步驟操作，取x=6 μl樣本測試，25℃ CAT酶促反應(yīng)10 min（T=10），加180 μl顯色工作液，常溫10 min，使用酶標(biāo)儀檢測波長405 nm，讀數(shù)：A標(biāo)準(zhǔn)=0.475，A空白=0.1，A對照=0.138，A測定=0.193，△標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.475-0.1=0.375，△測定=A測定-A對照=0.193-0.138=0.055，△A=△標(biāo)準(zhǔn)-△測定=0.375-0.055=0.32，CAT活性（U/ml）=0.32/0.375*0.081/0.006=11.5
4.2 按照樣本鮮重（FW）計算：
單位定義：在25℃ pH7.0的條件下，每g植物組織每分鐘內(nèi)可以催化分解1微摩爾過氧化氫為1個酶活力單位（U/g FW）。
計算公式：CAT活性（U/g FW）=
注解：
△標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白；△測定=A測定-A對照；△A=△標(biāo)準(zhǔn)-△測定
T（min）：10，CAT酶促反應(yīng)的實(shí)際時間為10 min
過氧化氫濃度（μmol/ml）：20，酶促反應(yīng)中使用的過氧化氫濃度為20 mM（μmol/ml）
V標(biāo)準(zhǔn)（ml）：0.09，酶促反應(yīng)中加入過氧化氫體積數(shù)為90 μl
顯色反應(yīng)總體積（ml）：0.3，顯色反應(yīng)總體積為0.3 ml
V樣總（ml）：加入提取液總體積
V樣（ml）：酶促反應(yīng)中加入的樣本體積x μl，轉(zhuǎn)換為ml數(shù)
W（g）：組織鮮重
D= 樣本稀釋倍數(shù)，未稀釋為1
1.5：300 μl反應(yīng)體系中取200 μl讀數(shù)
計算示例-綠蘿CAT活性測定-按照樣本鮮重（FW）計算：
取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，按照測定步驟操作，取x=6 μl樣本測試，25℃ CAT酶促反應(yīng)10 min（T=10），加180 μl顯色工作液，常溫10 min，使用酶標(biāo)儀檢測波長405 nm，讀數(shù)：A標(biāo)準(zhǔn)=0.475，A空白=0.1，A對照=0.138，A測定=0.193，△標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.475-0.1=0.375，△測定=A測定-A對照=0.193-0.138=0.055，△A=△標(biāo)準(zhǔn)-△測定=0.375-0.055=0.32，CAT活性（U/g FW）=0.32/0.375*5/0.006×0.27/0.5=383.8