JM109化學(xué)克隆感受態(tài)細(xì)胞
目錄號(hào)：RTX301
儲(chǔ)存條件：-70℃凍存六個(gè)月
產(chǎn)品包裝：
|
貨號(hào)
|
RTX301-04
|
|
JM109
|
50×100ml
|
|
Competent
cell Control Plasmid pUC18 (1 ng/μl)
|
10μl
|
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
本公司生產(chǎn)的JM109感受態(tài)細(xì)胞采用經(jīng)特殊工藝處理得到，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC18質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)108cfu/μg，-70℃保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
JM109菌株介紹：
基因型：endA1 recA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 (rk-,mk+) relA1 supE44 D (lac-proAB) [F′traD36 proAB laqI qZΔM15]
特點(diǎn)：用于藍(lán)白斑篩選；recA1和 endA1 的突變有利于克隆 DNA 的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA
的提取。
操作方法：（以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）
1取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無(wú)菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100
μl，可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。應(yīng)注意所用DNA體積不要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。
以下實(shí)驗(yàn)以100
μl感受態(tài)細(xì)胞為例。
2 向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA（50
μl的感受態(tài)細(xì)胞能夠被1 ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和），輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，在冰浴中靜置30分鐘。
3 將離心管置于42℃水浴中放置45秒，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，該過程不要搖動(dòng)離心管。
4 向每個(gè)離心管中加入500
μl 無(wú)菌的SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素）， 混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45分鐘（150轉(zhuǎn)/分鐘），目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。
5將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100
μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)12—16小時(shí)。
注：涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200—300
μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過離心（4,000 rpm, 2分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板）
注意事項(xiàng)：
1. 感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃，不可多次凍融和放置時(shí)間過長(zhǎng)，以避免感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。
2. 進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí)，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件的要求進(jìn)行。
3. 為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可以保留部分連接反應(yīng)液，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到最低。