PAGE膠蛋白微量回收試劑盒（貨號：RTD8108）
● 試劑盒組成：
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組份貨號
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試劑盒組成
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規(guī)格
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貯存
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RTD8108-01
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溶液A-洗脫液
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10 ml
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4-8℃
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RTD8108-02
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溶液B-助沉液
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5 ml
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4-8℃
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RTD8108-03
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溶液C-沉淀液
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10 ml
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4-8℃
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DT0140P-01
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1 M DTT（粉末）
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1 ml
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4-8℃
配制溶液后-20℃貯存
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CF-20
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過濾柱
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20套/包
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RT
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YMC07-5
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塑料研磨杵
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5個(gè)/包
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RT
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說明書
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1份
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● 運(yùn)輸、儲存條件和效期：
常溫運(yùn)輸，標(biāo)簽溫度保存，有效期為一年。
● 產(chǎn)品簡介及使用說明：
蛋白電泳不僅可用于檢測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，而且也是分離純化蛋白質(zhì)的重要工具之一，隨著蛋白質(zhì)技術(shù)的微量化，有必要從凝膠中回收蛋白質(zhì)以用于制備抗體、免疫印跡、氨基酸組分分析或末端序列測定等，本產(chǎn)品就是專門為此用途開發(fā)的微量蛋白膠回收法，回收效率在50-80%。
按照每次使用400 μl 溶液A計(jì)算，試劑盒至少可以使用20 次。
● 使用方法：
1. 電泳：
按常規(guī)方法進(jìn)行變性（SDS-PAGE）或非變性蛋白電泳（Native-PAGE）。
2. 切膠：
2.1 用手術(shù)刀片將銅染（貨號：RTD6207）或鋅染（貨號：RTD6206）的膠塊中含有目的條帶的部分膠切下（盡可能地把多余的膠切除，否則會影響回收效率），放入1.5 ml的離心管中，用相應(yīng)的消除液將膠中蛋白質(zhì)條帶脫色到膠體接近無色透明，超純水漂洗凝膠兩次，保留膠體進(jìn)行步驟3。
2.2 由于考馬斯亮藍(lán)染色蛋白的特殊性，不建議考染后進(jìn)行切膠操作。建議把樣品分多孔上樣，電泳后只切其中一個(gè)膠孔的膠條進(jìn)行染色，然后將此膠條放回到在整體膠中原來的位置，通過顯色膠條上的蛋白條帶找到在未染色膠上對應(yīng)區(qū)域，并切下膠體進(jìn)行步驟3。
2.3 如不進(jìn)行染色，可以使用預(yù)染Marker判斷目的蛋白的位置進(jìn)行切膠進(jìn)行步驟3。但此方法缺點(diǎn)在于蛋白的位置難以精確判斷。
3. 研磨處理：
3.1 稱取1.5 ml離心管中膠塊重量；用研磨杵充分將膠塊壓磨成盡可能細(xì)小的碎片。
3.2 即用型溶液A配制：
根據(jù)溶液A的使用量配制即用型溶液A的體積。配制比例為：1 ml溶液A加入10 μl 1 M DTT溶液。
3.3根據(jù)膠塊重量加入即用型溶液A，用研磨杵再次充分研磨，4℃搖床慢搖洗脫過夜（12-16小時(shí)）。
注：膠塊重量和即用型溶液A體積大體按照1:4比例加入，如膠塊100 mg加入400 μl即用型溶液A，溶液A使用量寧多勿少。洗脫時(shí)間與凝膠濃度，蛋白分子量大小有關(guān)，膠濃度越高，分子量越大，洗脫時(shí)間越長。
4. 過濾除膠：
用1 ml 的去尖吸頭吸取混合物至過濾柱中（過濾柱放入收集管中），注意將碎膠一起吸入，溶液過多時(shí)可分次加入，12,000 rpm 離心2分鐘，保留收集管中的濾出液（包含蛋白）。
5. 蛋白沉淀：
5.1 將濾出液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，加入1/10體積的溶液B-助沉液，混勻，常溫放置15 min。
5.2 加入步驟5.1溶液1/4體積的溶液C-沉淀液，充分混勻后，冰浴15 min。
注：加入溶液C后溶液變渾濁，需要徹底充分混勻。
5.3 4℃ 12,000
rpm離心10分鐘，去除上清，保留蛋白沉淀。
注：由于溶液B-助沉液的作用，此步驟得到管底很明顯的蛋白沉淀物。
6. 蛋白漂洗：
6.1 蛋白沉淀中加入1 ml預(yù)冷的丙酮（自備，試劑盒不提供），徹底重懸沉淀，混勻，冰浴放置15 min。
6.2 4℃ 12,000 rpm離心10分鐘，去除上清，保留沉淀。
注：通過丙酮的漂洗，去除步驟5.3中蛋白沉淀中的非蛋白組份。
6.3 離心管快甩離心，用10 μl吸頭將離心管中殘余溶液徹底吸凈，常溫開口風(fēng)干1-2分鐘，待殘留的液體揮發(fā)干凈。
7. 蛋白貯存：
選用合適的緩沖液溶解沉淀的蛋白質(zhì)，以方便進(jìn)行后續(xù)的電泳和質(zhì)譜測序等實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)示例：
鋅染后BSA切膠回收
40μl （20μg）BSA（0.5μg/μl）上樣，鋅染后
切膠回收，最后溶于40μl上樣緩沖液中
上樣5μl和10μl?；厥招矢哂?0%。