6%Tris-醋酸-SDS-PAGE電泳試劑盒（變性電泳，手灌膠）
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTD6162
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6%Tris-醋酸-SDS-PAGE電泳試劑盒（變性電泳，手灌膠）
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10次
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● 產(chǎn)品組成：
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTD6162-UA
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上層膠溶液A
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15
ml
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4℃
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RTD6162-UB
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彩色上層膠溶液B
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15
ml
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4℃
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RTD6162-LA06
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下層膠溶液A 6%
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30
ml
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4℃
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RTD6162-LB
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下層膠溶液B
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30
ml
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4℃
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TA1510
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400×抗氧化劑
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15
ml
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4℃
(配制后-20℃貯存)
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TA050
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10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液(變性電泳,溶液型）
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500
ml
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RT
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PL080-01
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5×MonoClolor蛋白上樣緩沖液 (變性，還原)
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1 ml
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-20℃
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RTD6202-02
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FastBlue蛋白快速染色液
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500 ml
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RT
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TA5030P
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10×Tris-醋酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（濕轉(zhuǎn)，粉末型）
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500
ml
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RT
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AP020P
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10%
APS（干粉）
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5
ml
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RT
(配制后-20℃貯存)
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TA0761-01
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TEMED
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0.5
ml
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4℃ 避光
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說明書
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一份
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-
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● 產(chǎn)品簡介：
Tris-醋酸-SDS-PAGE凝膠電泳適合于分離高分子量蛋白，可以有效分離50-500 kD范圍內(nèi)蛋白；電泳體系呈中性，能有效提高蛋白的穩(wěn)定性；電泳緩沖體系中加入抗氧化劑，整個電泳過程都在還原條件下進行，有效防止二硫鍵的形成。
該試劑盒包含凝膠制備、蛋白上樣、蛋白電泳、蛋白染色及轉(zhuǎn)膜所需的全部試劑。試劑盒配套的制膠溶液，可以配制10板厚度1mm凝膠（面積8×10 cm），分離膠濃度為6%，可以有效分離50-500 kD范圍內(nèi)蛋白。配好的凝膠濃縮膠為紅色，方便上樣。本試劑盒用于蛋白變性還原電泳，不適用于蛋白非變性電泳。
按照一次實驗電泳一板凝膠計算，本試劑盒可以使用10次。
● 貯存、運輸及效期：
按照標簽溫度貯存；試劑盒常溫運輸；有效期一年。
● 使用說明：
一. 實驗準備：
1.1 10%APS為干粉，用前加入5 ml超純水震蕩徹底溶解，適量分裝后取一管使用。溶解后的APS -20℃貯存。
1.2 400×抗氧化劑為干粉，用前加入15 ml超純水震蕩徹底溶解后使用，已經(jīng)溶解的400×抗氧化劑-20℃貯存。
二. 凝膠配制：
2.1參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
2.2 根據(jù)下表配制凝膠：
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下層膠配方
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上層膠配方
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膠厚度
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下層膠溶液B
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下層膠溶液A
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10%APS
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TEMED
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膠厚度
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彩色上層膠溶液B
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上層膠溶液A
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10%APS
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TEMED
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0.75 mm
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2 ml
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2 ml
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40 μl
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4 μl
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0.75 mm
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0.5 ml
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0.5 ml
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10 μl
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1 μl
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1.0 mm
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2.5 ml
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2.5 ml
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50 μl
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5 μl
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1.0 mm
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0.75 ml
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0.75 ml
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15 μl
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1.5 μl
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1.5 mm
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4 ml
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4 ml
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80 μl
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8 μl
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1.5 mm
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1 ml
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1 ml
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20 μl
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2 μl
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2.2.1 取等體積下層膠溶液B 和下層膠溶液A ，各
2.0/2.5/4.0 ml，混勻；
2.2.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的10%APS和4/5/8
μl的TEMED，輕輕混勻，將混勻后的溶液注入制膠玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長0.5 cm即可；
注意：此溶液為過量，請勿全部注入。
2.2.3 沿玻璃板緩慢加入適量滅菌水或無水乙醇覆蓋于下層膠之上，待下層膠凝固后，倒去上層水或乙醇；
注意：當水（乙醇）和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝固；25℃時10-15分鐘可以聚合。
2.2.4 取等體積彩色上層膠溶液B和上層膠溶液A ，各
0.5/0.75/1.0 ml，混勻；
2.2.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的10%APS和1/1.5/2
μl 的TEMED，輕輕混勻，插入梳齒；
2.2.6 待上層膠凝固后 （約20-40
min），拔去梳齒即可用于電泳。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。
上層膠25℃ 20-25分鐘可以聚合；18℃ 35-40分鐘可以聚合。
三. 電泳：
3.1 準備1×電泳緩沖液：
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總體積
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1000
ml
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10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液
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100 ml
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超純水
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900 ml
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3.1.1 外槽緩沖液：取適量體積1×電泳緩沖液用于外槽緩沖液。
3.1.2 內(nèi)槽緩沖液：200 ml 1×電泳緩沖液中加0.5 ml 400×抗氧化劑，混合均勻后用于內(nèi)槽緩沖液。
3.2準備上樣樣品：
注：表格以配制10 μl樣品為例，其他體積按照比例調(diào)整。
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總體積10 μl
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組份
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還原樣品
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蛋白樣品
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x μl
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5×MonoClolor蛋白上樣緩沖液 (變性，還原)
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2 μl
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超純水
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補至10 μl
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95℃ 10分鐘
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3.3電泳過程；
在電泳槽的內(nèi)槽加入內(nèi)槽緩沖液（已加入抗氧化劑），讓電泳緩沖液漫過加樣孔，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次；隨后在電泳槽外槽加入適量的外槽緩沖液（不用添加抗氧化劑）。上樣，電泳。
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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電泳時間
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200
V
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65-75 mA/板膠
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35-55 mA/板膠
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50+min
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注：冰浴電泳（可選）
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四. 染色：
注：如果只是觀察蛋白的分離情況，對凝膠進行染色。如果要后續(xù)進行WB實驗，凝膠不要染色，進行步驟五。
4.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適），搖床常溫搖動，條帶5-10分鐘即可見（蛋白含量高于1
μg條帶）。
4.2 搖床常溫繼續(xù)搖動15-30分鐘至條帶清晰可見。
4.3 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。
4.4 觀察保存結(jié)果。
五. 轉(zhuǎn)膜：
5.1 轉(zhuǎn)印膜選擇：
Tris-醋酸凝膠轉(zhuǎn)膜可以使用NC膜和PVDF膜，需要選擇0.45 μm孔徑。PVDF膜使用前注意需要用甲醇潤濕活化。
5.2 10×Tris-醋酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（溶液型）配制：
將10×Tris-醋酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（濕轉(zhuǎn)，粉末型）粉末溶解于500 ml超純水中，即配成500 ml 10×Tris-醋酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（溶液型），不要調(diào)節(jié)pH，pH~7.2。
5.3 準備1×轉(zhuǎn)膜緩沖液：
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1×即用型轉(zhuǎn)膜緩沖液 配制量 1升
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10×Tris-醋酸轉(zhuǎn)膜緩沖液(溶液型)
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100
ml
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20-80 kD蛋白
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無水甲醇
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10%
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SDS
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0.05%
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＞80 kD蛋白
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無水甲醇
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10%（NC膜）
0-5%（PVDF膜）
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SDS
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0.1%
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超純水
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定容至1升，不要調(diào)節(jié)pH，pH~7.2
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注：甲醇和SDS在轉(zhuǎn)膜中有拮抗作用。甲醇使蛋白更加結(jié)合在膜上，而SDS讓蛋白更加離開膜。因此對大蛋白轉(zhuǎn)膜來說，多加SDS，少加甲醇；而對小蛋白轉(zhuǎn)膜，多加甲醇，少加SDS。
5.4 轉(zhuǎn)膜條件：
高分子量蛋白建議濕轉(zhuǎn)。以下轉(zhuǎn)膜條件僅供參考，客戶針對自己的目的蛋白，最好經(jīng)過1-2次預(yù)實驗后，確定最佳的轉(zhuǎn)膜條件。
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膜孔徑
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蛋白大小
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穩(wěn)流
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建議時間
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降溫措施
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0.45 μm
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50-200 kD
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350 mA
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~60分鐘
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需要
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0.45 μm
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高于200
kD
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350 mA
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~2-3小時
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需要
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六. 實驗示例：
凝膠：6%Tris醋酸手灌膠
電泳：1×TAS 200V 70-42mA 55min；內(nèi)槽加抗氧化劑
染色：FastBlue蛋白染色液染色 15 分鐘
樣品：4K-BME-細菌裂解物；K562-懸浮細胞RIPA提取總蛋白